一、参考已有文献和预实验基础
1. 文献调研
优先查阅相同药物、相同或同类细胞的研究，记录文献中使用的剂量范围（如μM、nM、μg/mL等），作为初始参考。
若为新化合物，可参考结构类似物的剂量，或根据药物分子量、溶解度初步估算起始浓度。
2. 预实验摸索浓度范围
先用宽泛的浓度梯度（如10倍梯度：0.1、1、10、100 μM）进行预实验，观察细胞对药物的基本反应（如存活、形态变化），缩小有效剂量区间
二、通过毒性实验确定安全剂量上限
需先排除过高剂量的细胞毒性干扰，常用方法为细胞活力检测。
1. 选择检测方法
常用MTT、CCK-8、ATP检测或活死细胞染色等，评估不同浓度药物处理后细胞的存活率。
2. 确定“最大安全剂量”
计算药物处理后细胞存活率≥80%的最高浓度（即IC20，抑制20%细胞活力的浓度），通常以此作为剂量上限，避免非特异性毒性影响实验结果。
三、通过功能实验确定有效剂量范围
在安全剂量范围内，结合实验目的（如增殖、凋亡、分化、信号通路调控等）检测药物的生物学效应。
1. 设置精细浓度梯度
在预实验缩小的区间内设置更密集的梯度（如2倍梯度：1、2、4、8 μM），确保能捕捉到剂量-效应关系。
2. 检测功能指标
根据实验目标选择指标，例如：
研究增殖：检测EdU掺入、细胞计数
研究凋亡：检测caspase活性、Annexin V染色
研究通路：检测蛋白磷酸化水平（如Western blot）
3. 确定“有效剂量”
选择能稳定诱导预期生物学效应（如显著促进/抑制目标指标）且剂量-效应关系明确的浓度范围（如低、中、高三个有效剂量，便于结果重复）。
四、考虑其他关键因素
1. 药物处理时间
剂量与处理时间相关：短期处理（如6-24 h）可能需较高浓度，长期处理（如72 h以上）需降低浓度以减少累积毒性。
2. 药物溶解度与溶剂影响
确保药物完全溶解（避免沉淀），同时设置溶剂对照组（如DMSO、PBS），排除溶剂本身对细胞的影响（溶剂浓度通常≤0.1%）
3. 细胞类型差异
不同细胞对药物的敏感性差异较大（如肿瘤细胞vs正常细胞），需针对具体细胞系单独优化剂量。
五、最终确定实验剂量
综合毒性实验的安全上限和功能实验的有效区间，选择3-5个浓度进行正式实验，需满足：
无明显毒性（存活率≥80%）
能稳定诱导预期的生物学效应
存在清晰的剂量-效应关系（如随浓度升高，效应增强或达到平台期）
1. 文献调研
优先查阅相同药物、相同或同类细胞的研究，记录文献中使用的剂量范围（如μM、nM、μg/mL等），作为初始参考。
若为新化合物，可参考结构类似物的剂量，或根据药物分子量、溶解度初步估算起始浓度。
2. 预实验摸索浓度范围
先用宽泛的浓度梯度（如10倍梯度：0.1、1、10、100 μM）进行预实验，观察细胞对药物的基本反应（如存活、形态变化），缩小有效剂量区间
二、通过毒性实验确定安全剂量上限
需先排除过高剂量的细胞毒性干扰，常用方法为细胞活力检测。
1. 选择检测方法
常用MTT、CCK-8、ATP检测或活死细胞染色等，评估不同浓度药物处理后细胞的存活率。
2. 确定“最大安全剂量”
计算药物处理后细胞存活率≥80%的最高浓度（即IC20，抑制20%细胞活力的浓度），通常以此作为剂量上限，避免非特异性毒性影响实验结果。
三、通过功能实验确定有效剂量范围
在安全剂量范围内，结合实验目的（如增殖、凋亡、分化、信号通路调控等）检测药物的生物学效应。
1. 设置精细浓度梯度
在预实验缩小的区间内设置更密集的梯度（如2倍梯度：1、2、4、8 μM），确保能捕捉到剂量-效应关系。
2. 检测功能指标
根据实验目标选择指标，例如：
研究增殖：检测EdU掺入、细胞计数
研究凋亡：检测caspase活性、Annexin V染色
研究通路：检测蛋白磷酸化水平（如Western blot）
3. 确定“有效剂量”
选择能稳定诱导预期生物学效应（如显著促进/抑制目标指标）且剂量-效应关系明确的浓度范围（如低、中、高三个有效剂量，便于结果重复）。
四、考虑其他关键因素
1. 药物处理时间
剂量与处理时间相关：短期处理（如6-24 h）可能需较高浓度，长期处理（如72 h以上）需降低浓度以减少累积毒性。
2. 药物溶解度与溶剂影响
确保药物完全溶解（避免沉淀），同时设置溶剂对照组（如DMSO、PBS），排除溶剂本身对细胞的影响（溶剂浓度通常≤0.1%）
3. 细胞类型差异
不同细胞对药物的敏感性差异较大（如肿瘤细胞vs正常细胞），需针对具体细胞系单独优化剂量。
五、最终确定实验剂量
综合毒性实验的安全上限和功能实验的有效区间，选择3-5个浓度进行正式实验，需满足：
无明显毒性（存活率≥80%）
能稳定诱导预期的生物学效应
存在清晰的剂量-效应关系（如随浓度升高，效应增强或达到平台期）
