原理
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP，EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。CheKine™ 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性检测试剂盒（微量法）可检测植物组织样本。在该试剂盒中，AGP催化的逆向反应生成G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340 nm下测定NADPH增加速率，即可计算AGP活性。
包装清单
试剂盒组分 规格 储存条件
48 T 96 T
Extraction Buffer 60 mL 60×2 mL 4℃
ReagentⅠ 3 mL 6 mL 4℃
Reagent II A Powder×1 vial Powder×1 vial 4℃，避光保存
Reagent II B Powder×1 vial Powder×1 vial -20℃，避光保存
Reagent III Powder×1 vial Powder×1 vial -20℃，避光保存
Reagent IV Powder×1 vial Powder×1 vial -20℃，避光保存
Reagent V Powder×1 vial Powder×1 vial -20℃，避光保存
注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。
自备耗材
·酶标仪或紫外光分光光度计（能测340 nm处的吸光度）
·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
·水浴锅、低温离心机
·去离子水
·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备
Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
注意：Extraction Buffer有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。
ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
Working Reagent II：临用前配制；将Reagent II B转移至Reagent II A瓶中，48 T加入5.4 mL去离子水，96 T加入10.8 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。
Reagent III：临用前配制；48 T加入0.8 mL去离子水，96 T加入1.6 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。
Reagent IV：临用前配制；48 T加入0.8 mL去离子水，96 T加入1.6 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。
Reagent V：临用前配制；48 T加入0.8 mL去离子水，96 T加入1.6 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。
Working Reagent：每孔准备35 µL工作液，现配现用。按Reagent III：Reagent IV：Reagent V=1：1：1的比例配制，混合均匀。
样本制备
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。
植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
注意：1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。
2. 该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1372的测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外光分光光度计预热30 min以上，调节波长到340 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。
2. ReagentⅠ置于30℃孵育10 min。
3. 操作表（下述操作在1.5 mL EP管中操作）：
试剂 测定孔（μL）
样本 10
ReagentⅠ 50
Working Reagent II 80
混匀，30℃保温15 min，置沸水浴中1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却，4,000g，4℃离心5 min，取上清液。下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作：
上清液 80
Cooled ReagentⅠ 85
Working Reagent 35
4. 充分混匀，立即记录340 nm处10 s时吸光值A1和130 s时的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.02可适当加大样本量。如果ΔA大于0.6，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。若ΔA出现负值，则说明样本中不含AGP或已降解。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
AGP活性的计算
A. 使用96孔UV板测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算：
酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
AGP (U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T×1.75=5,627×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算：
酶活单位定义：每克样本每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
AGP (U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T×1.75=5,627×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L /mol /cm；d：96孔UV板光径，0.5 cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；1.75：稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中光径d：0.5 cm调整为d：1 cm进行计算即可。
注意事项
1. 在96孔UV板或微量石英比色皿中的操作，建议使用冷却至室温的ReagentⅠ，否则将会造成读数背景高。
结果展示
以下数据仅供参考，实验者需根据自己的实验对样品进行检测。
Figure 1. 本试剂盒测定南瓜和玉米种子中AGP的活性。
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KTB1371 CheKine™ 淀粉含量检测试剂盒（微量法）
KTB1372 CheKine™ 可溶性淀粉合成酶（SSS）活性检测试剂盒（微量法）
KTB1373 CheKine™ 结合态淀粉合成酶（GBSS）活性检测试剂盒（微量法）
KTB1390 CheKine™ 淀粉分支酶（SBE）活性检测试剂盒（微量法）
免责声明
本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP，EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。CheKine™ 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性检测试剂盒（微量法）可检测植物组织样本。在该试剂盒中，AGP催化的逆向反应生成G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340 nm下测定NADPH增加速率，即可计算AGP活性。
包装清单
试剂盒组分 规格 储存条件
48 T 96 T
Extraction Buffer 60 mL 60×2 mL 4℃
ReagentⅠ 3 mL 6 mL 4℃
Reagent II A Powder×1 vial Powder×1 vial 4℃，避光保存
Reagent II B Powder×1 vial Powder×1 vial -20℃，避光保存
Reagent III Powder×1 vial Powder×1 vial -20℃，避光保存
Reagent IV Powder×1 vial Powder×1 vial -20℃，避光保存
Reagent V Powder×1 vial Powder×1 vial -20℃，避光保存
注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。
自备耗材
·酶标仪或紫外光分光光度计（能测340 nm处的吸光度）
·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
·水浴锅、低温离心机
·去离子水
·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备
Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
注意：Extraction Buffer有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。
ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
Working Reagent II：临用前配制；将Reagent II B转移至Reagent II A瓶中，48 T加入5.4 mL去离子水，96 T加入10.8 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。
Reagent III：临用前配制；48 T加入0.8 mL去离子水，96 T加入1.6 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。
Reagent IV：临用前配制；48 T加入0.8 mL去离子水，96 T加入1.6 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。
Reagent V：临用前配制；48 T加入0.8 mL去离子水，96 T加入1.6 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。
Working Reagent：每孔准备35 µL工作液，现配现用。按Reagent III：Reagent IV：Reagent V=1：1：1的比例配制，混合均匀。
样本制备
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。
植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
注意：1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。
2. 该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1372的测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外光分光光度计预热30 min以上，调节波长到340 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。
2. ReagentⅠ置于30℃孵育10 min。
3. 操作表（下述操作在1.5 mL EP管中操作）：
试剂 测定孔（μL）
样本 10
ReagentⅠ 50
Working Reagent II 80
混匀，30℃保温15 min，置沸水浴中1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却，4,000g，4℃离心5 min，取上清液。下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作：
上清液 80
Cooled ReagentⅠ 85
Working Reagent 35
4. 充分混匀，立即记录340 nm处10 s时吸光值A1和130 s时的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.02可适当加大样本量。如果ΔA大于0.6，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。若ΔA出现负值，则说明样本中不含AGP或已降解。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
AGP活性的计算
A. 使用96孔UV板测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算：
酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
AGP (U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T×1.75=5,627×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算：
酶活单位定义：每克样本每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
AGP (U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T×1.75=5,627×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L /mol /cm；d：96孔UV板光径，0.5 cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；1.75：稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中光径d：0.5 cm调整为d：1 cm进行计算即可。
注意事项
1. 在96孔UV板或微量石英比色皿中的操作，建议使用冷却至室温的ReagentⅠ，否则将会造成读数背景高。
结果展示
以下数据仅供参考，实验者需根据自己的实验对样品进行检测。
Figure 1. 本试剂盒测定南瓜和玉米种子中AGP的活性。
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KTB1372 CheKine™ 可溶性淀粉合成酶（SSS）活性检测试剂盒（微量法）
KTB1373 CheKine™ 结合态淀粉合成酶（GBSS）活性检测试剂盒（微量法）
KTB1390 CheKine™ 淀粉分支酶（SBE）活性检测试剂盒（微量法）
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本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
