申请专利号：CN93104722.6
专利申请日：1993.05.10
名称：虎纹捕鸟蜘蛛毒素的提取与应用
公开（公告）号：CN1079475
公开（公告）日：1993.12.15
类别：化学；冶金
申请（专利权）：湖南师范大学; 北京大学
地址：410000湖南省长沙市湖南师范大学
发明（设计）人：梁宋平; 张东裔; 周培爱
专利代理机构：北京大学专利事务所
代理人：孙博宁
“虎纹捕鸟蛛毒素－Ⅰ”为一新型哺乳动物神经毒素，它是从我国虎纹捕鸟蜘蛛中经反相和离子交换高效液相色谱提纯的，其化学结构为由３３个氨基酸残基以特定的顺序组成的多肽，含有三对链内二硫键。它能不可逆地阻断哺乳动物神经肌肉接头传递，可作为工具试剂应用于神经生物学和药理学研究中。
主权项
一种从虎纹捕鸟蜘珠中提新型哺乳动神经毒素的虎纹捕鸟蛛 毒素－I（huwentoxin-I）的方法，其特征在于所述方法包括： 1）毒液的采集： 将3－4根长为4厘米肉径为1．5毫米的透明塑料软管捆成一束作为 诱物，用大镊子从侧面夹住蜘蛛胸部，蜘蛛便张开螯爪，这时将软管 柬诱物送入螯爪下，它即用触肢抱住软管束，将螯爪有力地刺入软管 **出毒液，上述过程可进行多次，使蜘蛛每个螯爪的毒液全部射出， 射毒后从螯爪下慢慢抽出轮管束，用微量注射器将其中的毒液抽出， 经冰冻干燥后得到的白色（略带黄色）干粉即为粗毒； 2）粗毒的纯化： 将1－3毫克上述粗毒溶于200微升双蒸水中，上样到事先用0．1％ 三氯乙酸平衡好的C4反相色谱柱中（美国Waters公司出品，Delta pak，C4200A， 30×0．46cm），用0％－70％乙腈梯度洗脱，柱温45℃， 时间120分钟，流速0，7m1／min，洗脱结果共分到约23个紫外吸收峰（ 220nm） （见风附图－1），其中的A峰即含有huwnetoxin－I，收集A 峰洗脱液，冰冻干燥后溶于双蒸水中，上样到事先用0．02M磷酸钠缓 冲渡：（pH6．6）平衡的WCX－1离子交换高效液相色谱柱中（日本岛律 公司，5×0．4cm），用0％－45％1M乙酸钠（PH7，0）溶液梯度洗脱、 时间30分钟，流速0．8m1／min，结果得到两个紫外吸收峰（220nm） （见附图2），其中第二个峰即为hnwentoxin－I，将第二峰收集液 用国产YWG－C18柱脱盐后，冰冻干燥即为纯净的产品，用上述方法得 到的hnwentoxin－I用SDS凝胶电泳和等电点聚焦电泳测试皆为一条 区带； huwentoxin－I经MilliGet
66c0型蛋白质顺序分析仪多次测定， 以及系统二硫键定位法测定出其化学结构如下： 3）用小白鼠膈神经－膈肌标标本研究了knwaatoxin－I的药理学性质； 将神经甩肉标本放在标本槽向，槽内温度维持在20－32C，用台氏液灌 流，并通以95％CO2和5％CO2的混合气体，50－70个气泡／分钟，并用 电子刺激器产生的方被脉冲通过吸力电极刺激神经戏直接刺激肌肉， 脉冲宽度0．2毫秒，刺激频率为每分钟12次，用半导体应变片张力传感 器将肌肉收缩的机械能转化为电信号，经放大后用笔新记录仪记录； 待收缩稳定后，换用治度为1X10－5g／ml的huwentoxin－I（用合氏液配 制）灌流标本，观察对肌肉收缩的影响；结果表明在上述液度的毒素 作用下，肌肉收缩幅度逐渐减小，最后停止在舒张状态，但对直接刺 激仍能产生正常的收缩反应，表明神经肌肉接头传递被阻断（见附图－ a）；在五例标本中，接头传递完全阻面所需时间为13．4＋1．3分钟， 冲洗半小时不能恢复，说明阻断是不可逆的；如用筒箭毒与 huwentoxin－I的混合液灌流标本，则可防止阻断作用的出现，表明毒 素的作用在突触后，与箭毒有竞争性关系； huwnetoxin－I对小鼠的毒性实验结果为腹腔注射LD50为0． 70 mg／kg体重，脑内注射LD50为9．40μg／kg； 上述结果证明huwnetoxin－I是一种较强的哺乳动物神经肌肉接 头传递的不可逆阻断剂。