摘要：本文综述了功能基因组学研究中的新热点——基因陷阱的原理与方法，应用和优缺点。
　　　　　关键词：基因陷阱；增强子陷阱；启动子陷阱；功能基因组学；疾病研究

随着许多生物(如拟南芥，水稻，酵母)整个基因组的破译，尤其是人类基因组框架图的完成，有关基因组的研究已从结构基因组时代进入功能基因组时代，即需要了解究竟有哪些碱基对应着生物体的何种功能。功能基因组研究的主要内容是利用结构基因组所提供的信息，发展和应用新的实验手段系统地分析基因的功能。目前鉴定功能基因的主要方法有基因表达的系统分析(SACE)、cDNA微阵列、蛋白组技术、基因芯片、基于转座子标签和T-DNA标签的反向遗传学技术等[1]。如今我们有了新的武器——基因陷阱(gene　teap)，它主要依靠报告基因的随机插入来产生融合转录物或融合蛋白，通过检测报道基因而推知基因及其功能。因这系列方法酷似以报道基因为诱饵来捕获基因，故得名基因陷阱。

基因陷阱(Genetrap)
　基因陷阱的实质是将带有能被特异激活表达的报告基因或内含子剪接的供体/受体序列的转座因子插入到基因组中,使**入基因座功能丧失或改变而表现出突变型,研究者则可通过转座因子的保守序列和报告基因的表达来识别插入突变体并分离捕获突变基因;它有别于一般转座因子插入钝化技术的特点在于:凡是报告基因得以表达的个体就表示转座因子插入到了功能基因附近或功能基因内部,因而,基因的识别是基于报道基因的表达,而不依赖于表型突变。另外,该技术有利于多效性基因和多基因家族的基因识别。报道基因（reporter gene）:与表达基因相连，便于测量基因的表达与否和表达量的基因　　　　　　　　　　

　　　　　　 1．基因陷阱的原理
　　　　　　　　　　目前已发展了三种不同的陷阱系统——增强子陷阱，启动子陷阱和基因陷阱。它们之间最大的不同体现在报道基因重组体的组成和插入位置上。基因陷阱是这三种方法的统称。
　　　　　　　　 1．1　增强子陷阱(enhancer trap)
　将某报道基因与一个精巧的启动子相连，组成一增强子陷阱重组体(见图1B)，它不会自主起始转录，而需由**入的细胞基因组中的增强子帮助才可转录。若报道基因最终表达，则可推知插入位点附近有增强子，或有基因，即实现了以该增强子陷阱重组体发现增强子的目的。
　　　　　 1．2　启动子陷阱(promoter trap)
　　　　　通过将报道基因插入到细胞基因组的外显子上(见图1C)，一旦发现它与细胞基因组基因被共同转录或表达，则可知该报道基因附近有启动子，从而起到了以之为诱饵，发现启动子的目的，这就是启动子陷阱。
　　

　　　　　　 1．3　基因陷阱(gene trap)　 基因陷阱重组体由报道基因和接受体剪接部位(splice acceptor，SA)组成(接受体剪接部位在报道基因上游)，该重组体需要插入到细胞基因组的内含子中随着基因转录和表达(见图1D)，故如能检测到融合转录物或融合蛋白，则证明插入位置附近有基因存在[2]。
　　　启动子陷阱和基因陷阱都有位置限制，前者需插入到外显子，后者则需插入到内含子，增强子陷阱却没有此位置限制；由于增强子与基因的位置可近可远，故增强子陷阱不易定位基因；此外，对启动子陷阱和基因陷阱而言，插入可能导致基因失活。
　　　　　　　下面以带SA的基因陷阱(即第三种基因陷阱)的一个成功例子具体阐明这一系统的工作原理。1998年Tate等以β-半乳糖苷酶-新霉素磷酸转移酶为报道基因，和上游的接受体剪接部位SA构成重组体，只有以正确的方向整合到内含子的表达基因才有可能被剪接成基因转录物或表达为融合蛋白，利用此基因陷阱“钓”出了一小批新的染色体蛋白和核蛋白[3]。　　　　　　

　　　　　 2．基因陷阱的特点
　　　　　基因陷阱的优势在于它只在表达水平上定位基因，细胞基因本身的转录和表达不受影响，所以可检测功能上多余的基因，也可检测在基因表达多个水平上都有作用的基因，或低水平表达的重要基因，而以前的功能基因组学的方法对这些基因都是无法确定的。
　　　　　 基因陷阱的不足主要表现在以下几个方面：
　　　 (1)表达基因的确定较困难且耗时长——如何克隆和筛选融合转录物或融合蛋白是一件很费时费力的事。通常根据所插入的报道基因的DNA序列为引物，用PCR技术获取两侧序列，再与EST数据库比较和确定基因功能。最近出现一些很好的解决方法，如在RACE的微透析和固相测序中采用自动化和荧光测序，可缩短时间；或只测一小段DNA序列即与EST数据库已有序列进行比较，若已有人研究过，则不用继续，若从没研究过，则应得到目的基因全长并分析其功能。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　 (2)突变的细胞的表型不明显——主要原因是被捕获的基因不一定有很明显的表达方式，以及突变的ES细胞克隆不一定有明显的表型。目前的解决方法是进行体外预先筛选我们需要的融合基因株系。
　　　 (3)报道基因表型可能会丧失——若报道基因没按预期加以整合，或报道基因被剪接时整个被切除，都可能使报道基因表型丧失而无从着手。
　　　 (4)目前使用的基因陷阱系统对细胞的伤害大——毕竟基因陷阱是插入了一段外源DNA，所以是一种剧烈的方法，会有致死效应(美国加州大学Berkeley分校的实验室的细胞或胚胎致死频率是1/3)[4]。在一些情况下应采用柔和一些的方法，如进行重组体的置换而不是插入，用点突变，选择性地采用表型突变[5]。　　　　　　　　

　　　 3．基因陷阱的应用
　　　　　基因陷阱的应用主要集中在医疗和制药上，而目前小鼠是探讨人类生理过程最好的模型，因此许多应用性的工作都以小鼠作为研究对象。一般在小鼠中不使用增强子陷阱，其基因组很大但基因频率很低，故很难定位增强子；报道基因一般是lac-Z，它的上游有一个或多个受体剪接部位，由逆转录病毒引入全能胚胎干细胞，再移人小鼠种系中。1988年就已有人在小鼠细胞中使用基因陷阱[6]。最近美国国立卫生院(NIH)的科研人员报道以小鼠为材料，利用HIV-1慢病毒来研究哺乳动物的细胞分化和发现新的基因，而慢病毒作为基因陷阱载体，是因为他们可随机插入动物细胞的基因组并可长期表达[7]。法国和日本的科学家利用乙肝病毒(HBV)的DNA帮助基因陷阱的插入整合，来确定未知的肝癌相关基因。这说明可通过研究病毒基因的整合位点来确定人类疾病相关基因，同时证明这些由HBV构成的基因陷阱附近的基因对细胞增殖和生长有重要调控作用[8]。近些年来，许多著名的大学和研究所已建立自己的基因陷阱实验室，如英国牛津大学，美国冷泉港实验室等。此外，许多生物制药公司和研究团体都看好基因陷阱在生物医疗和制药方面的巨大潜力。如美国Lexicon Genetics Inc．以鼠为材料探讨疾病的分子基础，研究分泌蛋***偶联受体，离子信道蛋白和转运蛋白等来用于医药开发，为此而建立了自己的基因陷阱数据库和小鼠克隆总的文库，从而为生产和应用创造了一个整合的功能基因组平台[9]。Bay Genomics在鼠胚胎干细胞中利用基因陷阱来失活一些基因，而这些失活某些基因的干细胞可产生类似基因敲除的小鼠个体，利用这些小鼠研究与动脉粥样硬化和脂肪代谢有关的基因，探索气喘、肺结核的病理学，同时结合DNA微阵列和原位杂交来研究与心肺发育和致病有关的基因[10]。
　　　　　 　　　　　　　

　　　　　　　　　　　　　此外在植物中基因陷阱也有应用。最初人们为了观察T-DNA插入基因的频率而将不含启动子的抗生素基因转入烟草原生质体，若有抗性基因表达，则表示有融合基因表达。后来将报道基因改进为β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)便于用组织化学染色观察。一般常用的报道基因有GUS、绿色荧光蛋白、或使花色素增加的Lc基因。最近，转座子系统被用于提高增强子或基因陷阱在植物基因组中的插入频率。英国研究者在1998年就报道在拟南芥中，用玉米的Ac-Ds转座子系统。由Ds因子携带GUS作为报道基因，新霉素磷酸转移酶基因{对卡那霉素有抗性}作为选择标记，结果在发育中的毛状体和根毛中特异地表达了GUS基因，从而证明附近有增强子或基因存在[6]。
　　　　　 A　一条基因组DNA的某个基因(外显子为带斜线盒状部分；内含子为线状且用V型注出，表示会被切除；各基因陷阱重组体为空白盒状)。
　　 B　增强子陷阱。由启动子(TAVA)和报道基因(reporter)构成的重组体，插入到基因的增强子附近(图中所示为第二个外显子下游)，报道基因的启动子被该基因的增强子激活，导致报道基因表达(B．C．D图中带黑箭头区域表示外源插入部分)。
　　　 C　启动子陷阱。报道基因插入到基因外显子(图中所示为第二个外显子)之中，并借助该基因的增强子和启动子被转录和表达。
　　　　 D　基因陷阱。受体剪接部位和报道基因重组体插入基因内含子中，则转录时受体剪接部位与该基因内含子一起被切除，得到融合基因转录物。